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              iCubate生物技術平臺的核心技術是 arm-PCR (amplicon rescued multiplex PCR, patent pending) 多重擴增專利技術。

               從八十年代 Kerry Mullis 博士發明PCR開始,科學家們就試圖做多重反應:在一個反應體系里面擴增多個分子靶點?墒嵌嘀睾茈y做,有三個主要原因:(1)靶點不兼容。擴增一個靶分子的一對引物通常不能和另一對引物共用一個最佳反應條件。引物越多,反應越難優化,一般超過五個靶點就很難了;(2)擴增背景過高。因為每對引物都有一個為了檢測用的標記,引物之間的非特異性反應就會產生除很多背景;(3)可重復性差。因為引物合成純化程度不同,每一批引物反應條件都可能不同,因此產品經常不穩定,好不容易優化好了一個多重反應體系,試劑用完后再合成,結果又變得不確定了。

              上面提到的第一個難題(不兼容)使得多重PCR為基礎的分子鑒別診斷試劑研發非常困難;第二個難題(高背景)使得自動化非常困難;而第三個難題(難重復)使得報批很難。因為有這三個難點,分子鑒別診斷的產業化就遲遲沒能實現。

              另一個多重擴增技術tem-PCR解決了上述三個主要難題。如圖所示,針對每個要共同擴增的靶點,tem-PCR 要求設計兩對,巢式引物,Fo是外面前向引物,Fi是里面前向引物,Ro是外圍反向引物, Ri是內部反向引物。內部引物(Fi, Ri)有一個所有靶點都共用的“尾巴”,這個共用區可以被另一對“超級引物” (SuperPrimer) 所識別雜交。反向超級引物(RS)上面帶有生物素標記,產生出的產物可以通過介于引物之間的雜交檢測探針(Detection Probe) 識別。設立PCR反應的時候,所有巢式引物和超級引物都一同進入反應體系,但是那些基因特異性的巢式引物的濃度非常非常低,只有超級引物的濃度是夠用來做指數增長擴增的。反向超級引物的濃度還比正向高四倍,這樣非對稱PCR反應的結果就是體系內大量單鏈DNA, 便于雜交檢測。

                                     

            tem-PCR 成功地解決了靶點不兼容的問題。因為如果做常規多重PCR, 假設要擴增十個靶點,每個靶點的引物都再規定的退火溫度下都很難達到最佳反應狀態。利用巢式引物,因為內外交替有四個排列組合機會(Fo/Ro, Fo/Ri, Fi/Ro, Fi/Ri) ,因此,再任何一個給定的退火溫度條件下,對某一個靶點來講,都有四個形成產物的機會。這樣就解決了靶點不兼容的問題。

               tem-PCR也解決了高背景的問題。因為如果用常規PCR, 每個靶點都需要有一個引物帶有生物素標記,這樣引物之間的結合就可能產生背景。用tem-PCR 整個反應體系里面僅有一個帶有標記的引物(RS)所以那些由引物之間相互作用產生出的產物因為沒有標記而不被檢測。

              最后,可重復性差的問題也得到了很好的解決。因為巢式引物的濃度非常低,一次生產可以使用很久,這就避免了批間差的問題,使產品更加穩定。

              tem-PCR 還有另一個附加的好處,就是它是半定量的。因為所有共同擴增的靶點都是通過超級引物達到指數增長擴增的,反應效率都是一樣的,因此,即使是反應終點進行分析,各靶點之間的比例關系還是保持相對不變的。這個半定量的特點對遺傳。ɑ蚩截悢,缺失等)的研究,感染性疾病的主要和次要感染源的識別等都非常重要。
            下表列出一系列用tem-PCR技術開發出來的臨床分子鑒別診斷產品和對該產品進行臨床驗證的有關論文。 
            Panel name  Detected pathogens  Publications 
            ResPlex I (The bacteria panel)   Mycoplasma pneumoniae, Leginella pneu-mophila, Chlamydia pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae  Direct Screening of Clinical Specimens for Multiple Respiratory Pathogens Using the Genaco Respiratory Panels 1 and 2. Diagn Mol Pathol. 2006. 15(3): 169. Brun-stein & Thomas. Development and Evaluation of a Novel Multiplex PCR Technology for Molecu-lar Differential Detection of Bacterial Respiratory Disease Pathogens. Journal of Clinical Microbiology. 2008. 46(6): 2074. Benson et al.  
            ResPlex II (The viral panel)   Adenoviruses, Influenza A, Influenza B, Respiratory syncytial virus A and B, Parainfluenza virus types 1-4, Human metapneumovirus, Rhinoviruses, Cox-sackie viruses, Echoviruses  Simultaneous Detection and High-throughput Identification of a Panel of RNA Viruses Causing Respiratory Tract Infections. Journal of Clinical Microbiology. 2007. 45(7): 2105. Haijing Li et al., Evidence from Multiplex Molecular Assays for Complex Multipathogen Interac-tions in Acute Respiratory Infections. Journal of Clinical Microbiology, 2008. 46(1): 97. Brunstein et al.  
            ResPlex III (Influenza typing)  H1, H2, H3, H5, H7, H9, N1, N2, NS-A, NS-B.  Human influenza A virus (H5N1) detection by a novel multiplex PCR typing method. Journal of Clinical Microbiology. 2007. 45(6):1889. Zhou et al. 
            StaphPlex (CoNS, MR-CoNS, MSSA, MRSA)   S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. simulans, S. aureus, Methicillin resistance, Community Acquired MRSA, Hospital Acquired MRSA, Aminoglycoside resistance, MLS resistance and Tetracycline resistance.  StaphPlex System for Rapid and Simultaneous Identification of Antibiotic Resis-tance Determinants and Panton-Valentine Leukocidin Detection of Staphylococci from Positive Blood Cultures. Journal of Clinical Microbiology. June 2007, 45(6): 1867. Staphylococcus pseudolugdunensis sp. Nov., a pyrrolidonyl arylami-dase/ornithine decarboxylase-positive bacterium isolated from blood cultures. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2008, 60:351  
            MVPlex (CoNS, MR-CoNS, MSSA, MRSA, VSE, VRE)   S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. simulans, S. aureus (methicillin sensitive or methicillin resis-tant), Vancomycin sensitive or resistant Enterococcus.  MVPlex Assay for Direct Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from Nares and other Swab Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 2008. 46(9): 3107. Podzorski et al. 
            HPV panel  25 subtypes of HPV  Simultaneous Ampli?cation and Identi?cation of 25 Human Papillomavirus Types with Templex Technology. Journal of Clinical Microbiology. Nov. 2006. 44(11): 4157. Han et al. 
            TB drug resistance  25 mutations related to resistance to four front line drugs: Isoniazid, Rifampin, Streptomycin, Ethambutol.  Prevalence of and Molecular Basis for Tuberculosis Drug Resistance in the Re-public of Georgia: Validation of a QIAplex System for Detection of Drug Resis-tance-Related Mutations. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2008. 52(2):725. Gegia et al. 

               雖然tem-PCR 是一個很好的多重擴增技術,但是它還有一些缺陷。比如說在使用這個tem-PCR/xMAP 產品組合的時候發現它有如下缺點: (1)分析敏感度不夠高。用同一個模板比例稀釋,然后比較一般實時PCR 和 tem-PCR, 后者的敏感性僅是前者的百分之一;(2)使用不方便。整個PCR反應的設立,雜交反應的設立,液態芯片儀器的設立都還很復雜,需要專門培訓的高級實驗室操作人員做實驗。(3) 時間過長。因為引物濃度低,為了提高擴增效率,每個周期都給很常的時間。(4)開放體系。這是最“頭痛”的問題,客戶希望設法避免開放體系帶來的污染危險。

              為了解決上述問題,我們研發了arm-PCR多重擴增專利技術,首先要解決的是敏感性不夠高和反應時間過長的問題。這些問題的產生原因是tem-PCR里面巢式引物的濃度太低。和任何酶反應一樣,PCR反應時,如果底物(引物)濃度低,那反應效率就一定很差。所以arm-PCR (如圖所示)的巢式引物濃度大大提高了。但是,arm-PCR與tem-PCR 的一個顯著差別就是共用引物(tem-PCR 里面的超級引物)不和巢式引物一起進入反應。在第一輪反應結束以后,用物理的方法把引物去掉,把第一輪擴增出的產物回收回來,然后再加入共用引物和新鮮的酶等試劑,再進行一輪指數增長式的擴增。這樣,arm-PCR的敏感性與tem-PCR 比增加了一百倍,時間也縮短了兩個小時。
             
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